Introducción
La regeneración de plantas sanas partiendo del cultivo in vitro de ápices meristemáticos de ciertos vegetales leñosos exige la búsqueda de técnicas complejas y su empleo acertado. Esas técnicas deben permitir al explante sortear frecuentes dificultades como la oxidación, la
heterogeneidad de respuestas, la reversión al estado juvenil, la presencia de inhibidores de
enraizamiento y, sobre todo, la sobrevivencia al trasplante en condiciones autótrofas.
El éxito obtenido en la regeneración de plantas libres de virus partiendo de los trabajos de Morelet al. (1952), que en la actualidad han producido comercialmente un centenar de especies herbáceas,no ha sido posible más que en contadas especies de frutales y forestales.
Buscando una mejor respuesta del ápice meristemático de algunos cítricos, Murashige et al. (1972) y Navarro et al. (1975) plantearon la posibilidad del microinjerto in vitro de ápices sobre plántulas provenientes de semillas, logrando así el desarrollo de plantas libres de numerosos |virus (Navarro y 5uárez, 1977; Roistacher, 1977).
El microinjerto in vitro fue aplicado más tarde al manzano (Alskief y Villemur, 1978), al damasco (Martínez et al., 1979) y a las vides (Engel- brccht y Schwerdtfeger, 1979) en las que se obtuvieron ejemplares libres de virus.
Introduciendo algunas modificaciones a las técnicas disponibles, fue posible regenerar plantas de duraznero libres de virus como Sharka o Plum Pox y algunas cepas del Necrotic Ringspot Virus (NRSV), cuando se microinjertaron in vitro ápices del cultivar GF 305 (Mosella, 1979). Por otra parte, Navarro et al. (1982) informaron acerca de la eliminación de virus como el Prunus Dwarf Virus (PDV) y el Chlorotic Leaf Spot Virus (CLSV) empleando el microinjerto de distintas variedades de duraznero.
Otra técnica, denominada ‘microinjerto in vivo’ de ápices meristemáti- cos pretratados in vitro, fue propuesta por Mosella et al. (l980b) e ilus- trada por Jonard et al. (1983). Con esta técnica se obtuvieron también plantas sanas de Prunus persica (L.) Batsch y con menos complicaciones que con la técnica original in vitro. En 1983, Ascui aplicó estos nuevos procedimientos a diversos cttricos y obtuvo resultados promisorios que esperan los indizajes virológicos correspondientes.
Ha sido posible también, en el curso de estas investigaciones, regenerar plantas a partir del
cultivo directo del ápice in vitro, tanto de duraznero
Procedimiento Microinjerto in vitro
1. Preparación del portalnjerto. Se describe la obtención de plántulas de
dos especies que se usarán como portmnjertos.
Duraznero. Las semillas desprovistas del endocarpo se esterilizan con alcohol de 950 durante 2 min y luego se tratan con hipoclorito.de calcio (99o-12@ ) >ás 0. 190 de Tween-20 durante 30 a 60 min.
Luego se enjua- gan tres o más veces con agua destilada estéril.
Las semillas se siembf n axI R£Qtic Cliente III 40 ml de medio nutritivo gelificado (Knop-Heller)' contenidos en tubos de vidrio de 170 x 30 mm que se.tapan con algodón hidrófobo y papel de aluminio. El medio de cultivos.contiene agar (8-9 g/ litro), sacarosa (40-60 gJ litro), y su pH se regYa entre 5.5 y 5.6.
En todos estos ensayos los medios fueron esterilizados en autoclave a 105 0Cdos veces: la primera durante 15 min, y 24 horas después durante 5 min.
La estratificación durante un lapso de 60 a 90 dlas a 4 0C en la oscuñdad
favorece la ruptura de la dormencia de Wunus persica cv. GF 305.
Luego de este plazo, y en un tiempo de 4 a 9 dlas a 27 0Cen la oscuridad, se obtienen las plántulas que servirán de portainjerto.
Citricos. Semillas del ‘citrange’ Troyer, cuyas cubiertas seminales han sido removidas, se esterilizan superficialmente con NaOCl(0.5i‹›Ia1 que se añaden algunas gotas de Tween-20 como agente humectante. Luego se enjuagan tres o más veces con agua destilada estéril. Se siembran las scijiillas así tratadas en 40 ml de medio nutritivo (Murashige et al., 1962) gelificado (l Qi), con 20 gJ litro de sacarosa, a un pH de 5.6, en tubos de vidrio de 170 x 30 mm y se colocan a 24 0C en la oscuridad; se logra así la germinación y cl crecimiento de las plántulas unos l5 días después.
En un lapso de 3 a 4 semanas, el epicótilo mide más o menos 6 cm de longitud y las plantas están ya listas para el microinjerto.
2. Obtención del ápice meristemático. El ápice meristemático mide de 0.2 a 0.4 mm en cítricos [(Citriis sinensis (L.) Osbeck cv. Thomson y Curtis fimon (L.) Burm. f. cvs. Génova, Eureka y Lisboa)] y de 0.6 a l mm en el duraznero (Z'. persica cv. GF 305); comprende el meristema propiamente dicho y uno o dos primordios foliares.
3. Microinjerto. Los portainjertos desarrollados en condiciones estériles se extraen del tubo de germinación en la cámara de flujo; se les secciona el epicótilo a 2 cm del cuello, y se eliminan los cotiledoiies lo mismo que las yemas laterales si se trata de cítricos. La operación se realiza sobre una caja Petri estéril.
4. Incubación. Los microinjcrtos se incuban en una cámara de ambiente controlado a 24::1:2 0C, con una intensidad lumlnica que varla de 600 lux (durazneros) a 1400-1600 lux.
5. Trasplante a mecetas. Logrado el desarrollo del injerto, las plántulas se extraen de los tubos y sus ralces sc‘ lavan profusamente con agua a fin de eliminar los restos del medio de cultivo. Luego se llevan a maletas que contienen un sustrato arena/ turba (509'¢-509’‹›) para los cltricos, y turba, tierra dc hoja y arena (en ciertas proporciones) para los durazneros. Estas mezclas se esterilizan previamente en autoclave a 130 0Cdurante 30 min, o directamente mediante la aplicación de vapor durante una hora.
En el duraznero, tanto las plantas madre infectadas con Sharka (raza Marcus) o con NRSV (raza G) o con ambos virus, como las plantas regeneradas mediante las diferentes técnicas descritas, pasaron por diver- sas y sucesivas pruebas de indicación virológica para comprobar la presen- cia oausencia de partículas virales en los tejidos; esas pruebas son las siguientes:
· Utilización de plantas indicadoras polivalentes: P. persica cv. GF 305 (Bernhard et al., 1969) y herbáceas como Nicotiana devela‘ndii, N. glutinosa, Chenopodiumfoetídum, Ch. amaranticolor, Pisum sativum, Cucumis sativus (Fulton, 1970; Marenaud y Mazy, 1977).
· Uso de microscopia electrónica con la técnica llamada ‘Leal-dip’ (Hitchborne y Hills, 1965).
· Uso de técnicas serológicas como ELISA (Clark et al., 1976).
Resultados y Discusión
Microinjerto in vltro
Con el protocolo clásico antes descrito se ha podido obtener entre 99 y 209s de plantas regeneradas (microinjertos prendidos) en el duraznero GF 305, y un 20W a 309 deregeneración de naranjo Thompson sobre citrange Troyer, resultados que concuerdan con los obtenidos por Alskief (1978) en P. persica Batsch y por Navarro et al. (1977) en diversos cítricos. Estos últimos responden muy bien al trasplante en macetas: hay 909c de sobrevivencia en esta operación; en cambio, con los durazneros no se supera el 20Po porque la mortalidad de las plantas por necrosis del portainjerto es grande.
Navarro et al. (1982) logran un 459 a 709'¢ de microinjertos prendidos en variedades de
durazneros, como Cardinal y Dixired, microinjertadas 524 sobre plántulas de Nemaguard que superan la etapa de trasplante en un 609o a 70P‹›. Nemaguard es un portainjerto menos susceptible a la anoxia radicular que el extremadamente sensible GF 305 (Leroux et al., 1976). Sin embargo, en esta técnica se pueden señalar algunas dificultades que la hacen lenta y complicada: las numerosas manipulaciones que sufre el portainjerto durante cu preparación,el estrés causado a la plántula, y la mayor posibilidad de contaminación y oxidación. Toda redundan en un escaso prendimiento de los injertos, en un fracaso en el trasplante, y en un alto costo de la operación, resultados que no se publican muy a menudo. La operación total de un microinjerto se demora 10 mín.
A pesar de todo, por este método y luego de la aplicación de diversas pruebas virológicas, se logró obtener un 659o de plantas de duraznero libres del virus Sharka y un 659o libres del NRSV que portaban las plantas madre. Otros virus del tipo ILAR (Prune Dwarf Virus, Cherry Rugose Mosaic Virus) y el Chlorotic Leal Spot Virus han sido eliminados en las plantas que Navarro et al. (1982) regeneraron con estos métodos.
Las modificaciones introducidas en estas técnicas clásicas por Mosella et al. (1979b) han permitido aumentar considerablemente la tasa de éxito de los injertos prendidos utilizando el sustrato vermiculita, el antioxidante (Dieca), y un pretratamiento de los ápices con ZEA. El uso de Dieca(1.5 g/ litro) en las zonas heridas, y un tratamiento de los ápices —previo al injerto— con ZEA (0. l mg/1itro) y de la zona decapitada in situ con citocinina(0. l mg/ litro) logran hasta un 84Q de éxito en los microinjertos en ciertas épocas del año; el promedio de toda la temporada es de 64Q.
Cuando se hacen todas las manipulaciones dentro del tubo que contiene el portainjerto, disminuyen notablemente el estrés de la plántula, las posibilidades de contaminación, y los riesgos de oxidación. La técnica aporta una mejora importante al desarrollo radical de la plántula, que aumenta a 329o el éxito del trasplante a macetas; proporciona también una gran rapidez en la manipulación del microinjerto porque logra hasta cinco y seis microinjertos cada 10 minutos, y disminuye considerablemente los volúmenes del medio nutritivo empleado. Finalmente, los porcentajes de plantas libres de virus obtenidos por esta técnica modificada permanecen invariables, y las plantas no presentan alteraciones fisiológicas ni morfoló- gicas, luego del trasplante y de su desarrollo, que las alejen de sus tipos parentales.
Microinjerto in vivo
La rápida elongación axial de los ápices —tanto de duraznero como de diversas variedades de limonero (Génova, Eureka y Lisboa)— obtenida al Cultivo de tejidos en la agricultura cultivarlos sobre el medio líquido MI 116 al que se han adicionado diversos biorreguladores y 30 g/litro de sacarosa, permite la obtención de explantes dc tamaño adecuado para hacer injertos sobre plantas cuyas semillas se sembraron en el invernadero.
Simplementando el medio básico con 0.02 mg/ litro de 2,4-D, l mg/ litro de AG, 0.01 mg/ litro de BAP o zeatina, y 470 mg/ litro de floridzina, se lograron crecimientos promedio de 8 y 9 mm en ápices de duraznero en un lapso de l5 días. La misma combinación de biorreguladores, esta vez sin la presencia de floridzina pero con 0. 1 mg/litro de BAP, permitió a los ápices de limonero alcanzar tamaños, en promedio, de 7 mm en 30 días (Ascui, 1983).
Al injertar estos.ápices pretratados in vitro sobre plantas desarrolladas en el invernadero se obtuvo un 77P de prendimiento y desarrollo en el cultivar GF 305 de duraznero con respecto al mismo cultivar de 80 a 120 días de edad, y un 30P de éxito en el injerto de Citrus limon respecto a plántulas de Citrus jambhiri Lusch de 4 a 6 semanas de edad; el prendimiento e inicio del desarrollo de los microinjertos se hizo evidcnte de los IE a los 21 dtas de permanencia en el invernadero. Se estima que este porcentaje de prendimiento puede mejorar en ambas especies, si se estudian algunas variables como la edad de los portainjertos, la aplicación de biorreguladores en la zona dcl injerto, el método de injerto aplicado, y el portainjerto utilizado.
Empleando esta técnica, se obtuvo un 72P de plantas de duraznero libres dcl virus Sharka y un 579 libres del NRSV, a pesar de que las plantas madre portaban esoc virus.
Diversos aspectos ventajosos destacan en el protocolo propuesto. En primer lugar, hay una
dis,minución considerable en las delicadas manipu- laciones requeridas en el microinjerto in vitro, quc economizan tiempo, mano de obra especializada y materiales; además, el rendimiento real de las plantas obtenidas es mayor; y principalmente, se supera el problema del trasplante al contar, en el momento del injerto, con plantas portainjerto desarrolladas normalmente.
Tanto en Citrus limon cv. Gónova como en Prunus persica cv. GF 305, se logró la regeneración de plantas bien enraizadas partiendo del cultivo directo dc ápices in vitro.
Cultivo directo de ápices
Tanto en Citrus limon cv. Gónova como en Prunus persica cv. GF 305, se logró la regeneración de plantas bien enraizadas partiendo del cultivo directo dc ápices in vitro. En el duraznero, los ápices, después de 20 a 30 días de cultivo in vitro sobre medios que favorecen su elongación, fueron especialmente repicados a medios gelificados (0.8:%) a los que se adicionaron auxinas (ANA o AIA, 0.5 mg/ litro) y compuestos fenólicos como la rutina o la quercetina(10-³ M); de esos ápices, 249, produjeron primordios radiculares en la oscuridad a 24° C, en un lapso de 2 a 3 semanas. Un nuevo cambio a un medio gelificado simple y sin hormonas (Knop m8s 10 g/ litro de sacarosa) y a un régimen de 6000 lux estimuló la elongación radicular y el desarrollo de la parte aérea de las plantas y determinó porcentajes de plantas libres. de virus similares a los obtenidos con las técnicas anteriores.
El trasplante a macetas continúa como la limitante de este tipo de regeneración pues el éxito de esta operación no supera el 20%. En el limonero, por su parte, un l0% de los ápices cultivados sobre el medio de elongación y repicados al medio MI116 gelificado que contenga 2 mg/ litro de ANA y 259, de carbón activado emitieron raíces.
Las técnicas resumidas en la Figura 23.5 permiten regenerar plantas de difícil respuesta al cultivo in vitro partiendo de ápices meristemáticos cuya longitud no sea superior a 1 mm; brindan además la posibilidad de obtener material vegetal libre de ciertos virus que afectan las plantas madre de frutales como el duraznero, sin recurrir a tratamientos termoterapéuticos. Estos protocolos son aplicables también a especies de cítricos como el limonero y el naranjo, y se consideran una importante herramienta para resolver problemas de limpieza de virus en otras especies leñosas frutales o forestales; se pueden aplicar además a ápices de origen diverso como los de plantas infectadas por patógenos sistémicos, los de callos organogénicos, los dc embriones somáticos, los de embriones inmaduros, y otros.
