martes, 30 de octubre de 2012

23.7.3. trasplante y adaptacion bajo condiciones de invernadero

2.3.7.3. TRASPLANTE Y ADAPTACIÓN BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO.

Las plántulas  entre  4 y 5 cm  obtenidas in vitro una vez que desarrollaron sus raíces y se han alongado, se traslada a un invernadero,  procurando realizar esta actividad  por la mañana para no dañarlas por el calor. Ya dentro del invernadero, la preaclimatización consistió  en  que los frascos se destaparan, dejándose bajo malla sombra durante 48 horas, con la finalidad de que las plantas comenzaran a adaptarse acondiciones diferentes a las existentes en el laboratorio donde estaban a temperatura promedio de 26 ± 2 ºc y fotoperiodo de 10 horas luz (lámparas de luz blanca fría fluorescente, con intensidad lumínica de 2000 lux) y 14 horas de oscuridad. Antes de transplantar, se elimina completamente el medio de cultivo de las raíces, para ello se colocaran las plántulas en un recipiente con agua limpia y el medio se eliminara de las raíces manualmente sin dañar  a las plántulas. Con la finalidad de evitar contaminación por enfermedades fungosas, las  plántulas se sumer durante cinco minutos  en un recipiente que contenga una solución preparada con fungicida. Para el trasplante se utiliza un sustrato el cual se esteriliza.  

2.3.7.2. desinfecion o esterilizacion del sustrato

2.3.7.2. DESINFECCION O ESTERILIZACION DEL SUSTRATO

En todo momento deberá realizarse un  riguroso control fitosanitario empleándose antibióticos, fungicidas e insecticidas de uso  universal
http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_I.pdf

2.3.7.1. tipos de sustratos

 2.3.7.1. TIPOS DE SUSTRATOS

Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la elección del substrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las raíces. Se puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita,  o mezclas de ellos, teniendo la precaución de realizar una esterilización previa. Es conveniente  el agregado de fertilizantes, sea a través  del substrato (fertilizantes de liberación  controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); empleándose  proporciones ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el  desarrollo radicular y la rustificación de las plantas.

2.3.7. trasplante al sustrato

2.3.7. TRASPLANTE AL SUSTRATO

En el momento en que se extraen los explantes enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Las plántulas recién enraizadas son sensibles a los cambios ambientales y esto va a depender del éxito o el fracaso. Mediante aclimatizacion (endurecimiento) entre 4-8 semanas
Paulatina y secuencialmente
1.       Se controla la luz desde el 20% hasta el 100%
2.       Sustrato en las 2 p´rimeras semanas riega ms 25%
3.       Hr se mantiene desde 100 normal
4.       Se mantiene con nebulización
5.       Normal se cortan las raíces de las plantas in vitro .
http://helmer-martinez.blogspot.mx/2012/04/237-trasplante-al-sustrato.html

2.3.6.4. readaptacion y trasplante

2.3.6.4. PREADAPTACION Y TRASPLANTE

Este período de adaptación al nuevo hábitat es llamado  fase o etapa de aclimatación. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deberá contemplar el control minucioso de los parámetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratación y, al mismo tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de generar un rápido crecimiento  de los plantines. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la escasa funcionalidad del aparato estomático que presentan las hojas de la mayoría de las especies cultivadas  in vitro, determinan una alta tasa de transpiración que puede ocasionar  la muerte por deshidratación. El control de este proceso fisiológico es de vital importancia durante la aclimatación, teniendo en cuenta que la disminución de la transpiración será gradual y dependerá de la rehabilitación de los estomas, así como también del desarrollo de la cutícula.
El equipamiento necesario estará sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde túneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiración (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a través del empleo de cámaras climatizadas (Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa.  En algunos casos puede resultar necesaria la aplicación exógena de ABA (hormona involucrada en el control del cierre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la superficie de la hoja. En este último caso deberán tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reacciones de fitotoxicidad.

2.3.6.3. enraizamiento

2.3.6.3. ENRAIZAMIENTO

 

Cambios durante formación de raíces
l  Formación de nuevos sitios meristemáticos
l  Marcado por división anticlinal
Ø  Divisiones celulares iniciales:
l  Grupos de células sin polaridad, simétricas, no determinadas
Ø  Divisiones laterales para formar meristema radical determinado:
l  1500 células, simetría bilateral
Ø  Crecimiento y emergencia (división y alargamiento):
l  Unión vascular con tallo
l  Raíz es visible
Causas para variabilidad de enraizamiento
Ø  Condiciones ambientales y de nutrición de la planta y de los esquejes
Ø  Manejo de los explantes luego de su separación de la planta madre
Ø  Concentración, método de aplicación y tipo de sustancia reguladora
Ø  Interacción entre sustancias RC
Ø  Edad de los esquejes
http://www.google.com.mx/

2.3.6.2. crecimiento de yemas adventicias

2.3.6.2. CRECIMIENTO DE YEMAS ADVENTICIAS

 

Se pueden iniciar nuevos ápices de ramas o brotes ya sea:
1.     Directamente del explante
2.     indirectamente del callo que se forma en la superficie cortada del explante.
Los dos factores más importantes que afectan la iniciación de brotes adventicios son:
1.     la relación del explante
2.     El régimen de hormonas que se suministran a las plantas.
Entre los tipos de explantes hay porciones de hojas que se usan en plantas como Saintpaulia y rábanos picantes que de manera natural se regeneran de esta forma. Se utilizan explantes de puntas de tallos en varias especies como en orquídeas, y helechos en los cuales se desarrollan masas de tejidos de tipo callo y regeneran a un gran numero de brotes, con el tiempo las plantas iniciadas de puntas de callos con el propósito inicial de brotes axilares, pueden revertir a formar alto porcentaje de brotes adventicios.
La iniciación directa principia con células de parenquima que están situadas ya sea en la epidermis o justo abajo de la superficie del tallo; algunas de esas células se vuelve meristemoides las cuales aparentemente se originan de células individuales, sin embargo, la respuesta de los explantes depende de la concentración de hormonas El desarrollo indirecto de brotes adventicios implica, primero la iniciación  de callo basal de los brotes separados en cultivos, Los brotes se originan en la periferia del callo e inicialmente no están conectados al tejido vascular del explante, de manera similar, en plantas intactas, si se aplica citoquinina en bloques de agar cilíndrico pueden originarse de brotes del callo formado en el ápice de epicotilos decapitados. En general la formación de brotes adventicios puede conducir a tasas muy elevadas de multiplicación, mas altas que los que se obtienen de ramas axilares. Por otra parte, los brotes adventicios pueden aumentar las tasas de producción de plantas aberrantes, resultantes de la partición de quimeras que en algunos cultivares resulta en la perdida de la variegacion y en reversiones a una condición más juvenil, cuando se use este sistema las plantas producidas deben evaluarse cuidadosamente respecto a la posible variación.
http://www.google.com.mx/url?

2.3.6.1. formacion de callo

2.3.6.1. FORMACION DE CALLO

Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, células en suspensión, etc.). Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos.

2.3.6. cambios fisiologicos del explante

2.3.6. CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE

Algunos de los cambios fisiológicos que presentan los explantes son los siguientes:
1.     Estomas atrofiados, no son funcionales al 100%.
2.     Cutícula más delgada y con aberturas.
3.     Parénquima desorganizado, no están unidas, es decir, es ineficiente.
4.     Con menos luz y azúcar en las plantas se realiza menos fotosíntesis y en gran porcentaje son heterótrofas y en poco porcentaje son autótrofas.
5.     Como tienen mucha humedad relativa las raíces son más delgadas, pocas raíces y no son funcionales.

2.3.5.4. humedad relativa

 2.3.5.4. HUMEDAD RELATIVA

La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmósfera gaseosa, es otro de los parámetros físicos a tener en cuenta. La HR dependerá del sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermético, la humedad interior será del 100 %. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso, la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso del contenido de HR puede promover una pérdida veloz de agua del medio de cultivo, variando la concentración de sus compuestos hasta llegar a niveles tóxicos.

2.3.5.3. temperatura

 2.3.5.3. TEMPERATURA

La temperatura de incubación de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en las condiciones naturales de cultivo las plantas tienen diferencias térmicas durante el día y la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante señalar que cuanto más se asemejen las condiciones in vitro a las óptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor será la respuesta esperada. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas, se observó que la regeneración mayor de brotes se obtuvo a 12 ºC, mientras que por encima de los 30 ºC casi no hubo diferenciación.
http://www.biblioteca.org.ar/libros/150404.pdf

2.3.5.2. intensidad luminica

2.3.5.2. INTENSIDAD LUMINICA

La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de losorganismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en loscultivos in vitro. Los aspectos aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in vitro son:
·       La cantidad de luz: LA IRRADIACIÓN . La irradiancia puede ser expresada en función de la energía por unidad de superficie W/m2
·       La calidad de la luz: EL ESPECTRO (λ) Los tubos fluorescentes son las fuente de luz más usada en las cámaras de cultivo.
http://www.biol.unlp.edu.ar/biologiavegetal/seminario05-2012.pdf

2.3.5.1.fotoperiodo

2.3.5.1. FOTOPERIODO

La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO. Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO. Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, floración, tuberización,...) pueden ser activados por el número de horas diarias de luz que recibe la planta. De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro. En general se utiliza luz blanca y un fotoperiodo de 16hs de luz y 8 hs de oscuridad. 

 

2.3.5 CONDICIONES DE INCUBACION

2.3.5. CONDICIONES DE INCUBACION


Factores relacionados con el ambiente de incubación
·       Luz, obscuridad o fotoperiodo
·       Tipo de luz
·       Temperatura
Como se puede ver el numero de factores implicados en el proceso de organogénesis es muy grande, y el fenómeno en si no se comprende lo suficiente como para manipularlo a partir de una base solida de conocimientos. Los conocimientos básicos que se tienen hasta la fecha provienen en su inmensa mayoría de experimentos de ensayo y error. Debido a esto al trabajar por primera vez con una especie deberán montarse experimentos que nos permitan desarrollar el mejor sistema para regenerar órganos a partir de ese material vegetal.

2.3.4.3. SIEMBRA DE DIFERENTES MEDIOS: SOLIDOS Y LIQUIDOS

2.3.4.3. SIEMBRA DE DIFERENTES MEDIOS: SOLIDOS Y LIQUIDOS

Consistencia del medio
El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del ágar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). El cultivo en medio líquido se utiliza cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías. El cultivo en medio líquido se utiliza cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías:
-        Inducción de embriogénesis
-        Cultivo de protoplastos
-        Cultivo de suspensiones celulares

2.3.4.2. DISECCION DEL EXPLANTE

2.3.4.2. DISECCION DEL EXPLANTE

Cultivar los explantes en una cámara de transferencia con aire estéril («gabinete de  flujo laminar»), localizada en un ambiente limpio  y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir  con cuartos esterilizados previamente  con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz  UV en forma directa). La mesada de trabajo  y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas  previamente con etanol al 70%. De  la misma manera deben ser desinfectados  exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen  en el área del aire estéril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminación, porque es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos  y antebrazos con abundante agua y jabón y se des infecten con etanol al 70 %. La  utilización de guardapolvos, guantes y máscaras protectoras de la boca y de la nariz, así  como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de  contaminación. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cápsulas de Petri)  deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos  de estos instrumentos pueden ser colocados  en etanol al 95% y, antes de ser usados,  se deben flamear cuidadosamente en  la llama de un mechero. También es necesario  flamear la boca de los recipientes que contienen  los medios de cultivo antes y después  de cultivar el explante. Incubar los cultivos en cámaras o cuartos  de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulación de personas, y  los recipientes con cultivos contaminados  deben ser rápidamente eliminados de este  sector. Es conveniente que antes del lavado,  estos cultivos sean esterilizados.

http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_I.pdf

2.3.4.1 Desinfección del ex plante

 2.3.4.1 Desinfección del ex plante
Lavado inicial con detergente para eliminar las partículas e impurezasmás grandes, seguido de una inmersión en alcohol de 95º; posteriormente unadesinfección inicial con NaOCl más fuerte que la segunda (también en NaOCl), y 3lavados con agua destilada estéril después de cada desinfección con NaOCl paraeliminar los restos de los compuestos químicos. El alcohol de 95º, además de servircomo agente bactericida, se utilizó como surfactante para que los tejidos fueranfácilmente penetrados por los siguientes germicidas (el NaOCl en este caso). Laprimera desinfección con NaOCl se utilizó siempre en mayor concentración que lasegunda, pues el tejido inicial (hojas superficiales del brote lateral entero) requeríauna desinfección sin importar el daño de ese tejido, ya que no era el explante deinterés; además, por tratarse de un brote cerrado, el contacto del alcohol y del NaOClde la primera desinfección difícilmente alcanzó el meristemo apical. La segundadesinfección con NaOCl se utilizó siempre en menor concentración respecto de la primera, pues ya para el momento de su realización, se habían eliminado algunas hojas.

2.3.4 Siembra del explante

2.3.4 Siembra del explante
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996). Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo. Una vez que los explantes luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de una semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo.
 Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas (explante) dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. Esto se realiza haciendo uso de una pinza esteril para evitar toda contaminación por microorganismos: hongos, bacterias, virus, esporas.
En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.
Es importante conservar la polaridad de la planta madre. Segmentos de tallos y yemas deben ser colocados en el medio con la polaridad adecuada

2.3.3.3 Tamaño del ex plante

2.3.3.3 Tamaño del ex plante
Entre más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos sean contaminados  con microorganismos.
El tamaño del explante es un factor que tambien puede determinar la respuesta in vitro. Explantes muy pequeños requieren el empleo de medios de cultivo mucho mas complejos y la vitalidad y la capacidad regenerativa tiende a ser bajas. Explantes grandes son mas difíciles de desinfectar pero generalmente poseen un mayor potencial regenerador considerablement mayor.  En varios trabajos se han demostrado las ventajas que ocasiona el pretratamiento de las plantas donantes con reguladores del crecimiento para reactivar el desarrollo de las plantas donantes.

2.3.3.2 Posición del ex plante en la planta

2.3.3.2 Posición del ex plante en la planta
Los explantes se colocaron en cajas Petri de 12 x 100 mm con 20 mL de medio de cultivo esterilizado.  Las variables de respuesta para este experimento fueron: porcentaje de explantes con capacidad de respuesta morfogénica, expresada en crecimiento de los bordes del explante; porcentaje de explantes con callogénesis; y porcentaje de explantes con callo embriogénico, esta última detectada con base en la presencia de embriones en diferentes estados de desarrollo (fase globular, acorazonado, torpedo y cotiledonar), en una muestra de 0.83 g de callo. La evaluación de las variables se llevó a cabo a los 60 d del establecimiento in vitro.

2.3.3.1 Tipo de ex plante

 2.3.3.1 Tipo de ex plante

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996).
Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.
Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de una semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo.

El material vegetal con el que se inicia un cultivo in vitro puede ser cualquier célula, tejido u órgano de la planta (explante).  Comúnmente se seleccionan aquellas partes de la planta que se encuentran en división activa, como las regiones meristemática:
·       Tejidos somáticos: de tallo, raíz, hoja, meristemos
·       Tejidos reproductores: anteras, polen, microesporas, óvulos, semillas
Si se elimina la pared celular de las celulas se obtiene un cultivo de protoplastos.

2.3.3.- EXPLANTE

 2.3.3.- EXPLANTE

Explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.), un órgano (semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas y raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien células individuales (como en el caso de los protoplastos3). Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticos.
El nombre “explante4” es una versión castellanizada del vocablo inglés “explante”; acuñado especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y sin otro significado. La selección del explante es un aspecto clave para tener éxito en el cultivo de tejidos, ya que dependiendo de su ubicación en la planta, del tipo de tejido que contiene, de su edad cronológica y fisiológica, de su contenido endógeno de hormonas, entre otros, se comportará de una manera o de otra.

2.3.2.5 Edad del órgano o tejido vegetal


2.3.2.5 Edad del órgano o tejido vegetal
Edad del órgano de la planta desde que ha sido extraída de su medio: edad biológica de la planta tiempo que ha transcurrido desde que la planta comenzó como retoño.
Gran parte del cultivo de tejidos, esta en la edad del explante que va ser utilizado para los trabajos. La edad de la planta y el grado de diferenciación del tejido muchas veces etas interrelacionados y pueden producir efectos interactivos se cultivan in vitro. Por ejemplo, según los experimentos realizados por Toivonenn y Kartha en 1988, quienes trabajaron con Pinus glauca, descubrieron que las plántulas a las que se les extirpo los cotiledones 7 a 8 días luego de ser plantadas, formaban las primeras yemas adventicias antes que plántulas cuyas yemas fueron extirpadas luego de los 8 dias. Asi también de yemas adventicias en explantes de hojas de Cucumis melo, mostraron mayor producción en los explantes que tenían un tamaño entre 0.3 y 0.5 mm los cuales tenían 14 días de plantados. Esta propiedad no tenia aquellos explantes que tenían más de 21 días. La edad del explante puede clasificarse en cuatro clases:
1.     Edad del órgano o de la planta que ha sido extraida: es al edad biológica de la planta, es el tiempo que transcurrió desde que la planta comenzó como retoño o como embrión.
2.     Edad fisiológica o ontogenetica o fase de crecimiento: incluye los conceptos de juvenilidad y adulto.
3.     El grado de diferenciación: con este concepto, las partes más jóvenes de la planta son células meristematicas no diferenciadas. Teóricamente se dice que algunas plantas poseen las células meristematicas siempre en estado juvenil y que podrían vivir para siempre.
4.     Periodo de cultivo: es el tiempo desde que recién se instala el cultivo.



2.3.2.4 Condiciones de crecimiento de la planta

2.3.2.4 Condiciones de crecimiento de la planta
Las plantas no son capaces de mantener su temperatura constante por lo que los cambios de temperatura ambiental influyen sobre su crecimiento y desarrollo, son poiquilotermas, pero esto no significa que su temperatura sea igual que la del ambiente, pueden haber diferencias. Lo que sí es cierto es que las variaciones de temperatura ambiental originan variaciones en la temperatura de la planta. Las variaciones de la temperatura ambiental son periódicas, diarias (día/noche) y estacionales, también se dan variaciones fluctuantes +/- previsibles como la variación de temperatura por nubosidad, variaciones dependientes de la posición de la hoja en la planta, las hojas tapadas por otras hojas tendrán menos temperatura, también depende de la velocidad del viento, altura de la hoja así como la forma de hoja. Además, la temperatura de la raíz no tiene porque ser igual a la temperatura de la parte aérea ya que las variaciones de temperatura llegan a la raíz con retardo respecto a las de la parte aérea. El régimen térmico dentro del vegetal es complejo ya que se dan variaciones de temperatura en las diferentes plantas. En el campo no se pueden realizar estudios y en el laboratorio es complicado reproducir las condiciones ambientales, por lo que no hay buenos estudios. Los diferentes procesos fisiológicos tienen diferentes temperaturas óptimas y tambien especies diferentes tienen diferentes temperaturas óptimas. Normalmente, para un proceso utilizamos:
temperatura óptima.
temperatura cardinal.
temperatura crítica.
La temperatura óptima se da cuando el proceso se realiza con la máxima eficiencia:
La temperatura cardinal es la temperatura por encima ó por debajo de la cual un proceso fisiológico se para, volviendo a funcionar cuando la temperatura está por encima de la mínima cardinal ó por debajo de la máxima cardinal.
La temperatura crítica son las temperaturas por debajo ó por encima de las cuales un proceso fisiológico sufre daños irreversibles y la planta muere. Estas dos temperaturas críticas (mín y máx) no son constantes durante la vida de la planta, sinó que pueden variar durante el desarrollo, así, una planta en pleno crecimiento vegetativo tiene una temperatura crítica + alta que una que esté en dormición.
http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2211/4_-_Cultivo_in_vitro.pdf?sequence=6

2.3.2.3 Edad de la planta


 2.3.2.3 Edad de la planta
Factor importante ya que los tejidos juveniles poseen un alto grado de actividad meristematica y tienden a tener mas plasticidad in vitro que los adultos.
Los tejidos juveniles presentan una mayor capacidad morfogenetica, la cual se manifiesta en respuesta de crecimiento, proliferación y enraizamiento, a diferencia de un tejido maduro el cual es mas difícil de desdiferenciar e inducir a la producción de raíces y brotes. 

2.3.2.2 Fitosanidad

2.3.2.2 Fitosanidad
Proceso de limpieza o Erradicación de Virus libre de agentates patogenos. El cultivo in vitro de tejidos vegetales resulta una herramienta potente, básica y necesaria, en la propagación de plantas que presentan dificultad para multiplicarse vegetativamente, abarcando una serie de técnicas para su manipulación y control. Básicamente consiste en el cultivo sobre un medio nutritivo artificial en condiciones asépticas. Así, las plantas completas o partes de ellas (explantes), como: semillas, embriones, órganos, tejidos, células y protoplastos, pertenecientes a diversas especies vegetales, son cultivadas in vitro. Dichas técnicas permiten controlar los procesos fisiológicos de crecimiento y desarrollo de la planta, como son: división celular, germinación, brotación, enraizamiento, floración y fructificación (8), además de que pueden desempeñar un papel importante en el suministro adecuado de vitroplantas como material de plantación.
La contaminación microbiana es uno de los problemas más graves en la micropropagación de especies vegetales a nivel mundial, produce cuantiosas pérdidas de material, tanto en los trabajos de investigación como en la micropropagación comercial. Puede tener dos orígenes: a) microorganismos que colonizan la superficie o el interior del explante (endófitos) y b) microorganismos introducidos durante la manipulación en el laboratorio. Los contaminantes más frecuentes en condiciones in vitro son los hongos, las bacterias y levaduras, denominados "vitropatógenos", aunque también existen otros menos frecuentes como los virus, viroides y microartrópodos (ácaros y trips). El término vitropatógeno ha sido usado para aquellos organismos que no son necesariamente patógenos para las plantas en el campo, pero sí son perjudiciales para células, tejidos u órganos cultivados in vitro, mientras que el término patógeno ha sido confinado para describir a un organismo que causa enfermedad a las plantas cultivadas en el campo. Se ha sugerido que los vitropatógenos pueden ser dañinos para el cultivo de tejidos vegetales, ya que compiten con el explante por los nutrientes del medio y les producen daños directos e indirectos por la colonización de sus tejidos o liberación al medio de metabolitos tóxicos, aunque en la actualidad no se encuentran muchos trabajos en la literatura científica que expliquen el mecanismo de acción de los contaminantes, que los hacen perjudiciales para las plantas in vitro.

Algunos encontraron que la inoculación de plantas in vitro de Hemerocallis con la bacteria no patógena Lactobacillus platarum, un contaminante frecuente del cultivo de tejidos, causaba una disminución del coeficiente de multiplicación, seguido de un rápido deterioro de los cultivos. Ellos refirieron, además, que esto coincidió con el incremento del número de bacterias y la concentración de ácido láctico en el medio de cultivo. Ellos demostraron que el efecto perjudicial de Lactobacillus plantarum era un resultado directo de la producción de ácido láctico, más que del efecto general de la disminución del pH. Los coeficientes de multiplicación de plantas infectadas con contaminantes bacterianos latentes pueden mantenerse inalterables, pero reiteradamente se ha referido que decrecen. No obstante, en el cultivo de células y tejidos vegetales, el efecto de la presencia de microorganismos no ha sido ampliamente examinado.
Entre las principales fuentes de contaminación bacteriana se citan los explantes, el ambiente de los locales de trabajo, los operadores y las técnicas deficientes de esterilización. Además, los microorganismos pueden diseminarse por ácaros, trips y hormigas. El ambiente de los locales de trabajo es una fuente de contaminación, ya sea directa o indirectamente. Se plantea que a través de las corrientes de aire, las partículas del suelo cargadas de esporas y células de microorganismos son arrastradas y penetran por los acondicionadores de aire, son transportadas e introducidas por el hombre y permanecen en el ambiente por condiciones higiénicas inadecuadas. Del mismo modo, el tipo de cultivo (anual o perenne), la forma de propagación (sexual o asexual) y las condiciones climáticas influyen en la gravedad de las contaminaciones. Las condiciones climáticas en zonas tropicales favorecen el desarrollo y la multiplicación de los microorganismos, que tienen un efecto negativo sobre los explantes. El éxito de los sistemas de propagación de plantas por biotecnología depende en gran medida del control y la prevención de la contaminación microbiana. Existen varias estrategias para controlar y manejar la contaminación, que incluyen la prevención mediante la selección y el tratamiento de la planta madre, la desinfección superficial del explante y la identificación de los microorganismos contaminantes, el control de la contaminación a través del uso de sustancias antimicrobianas y el cultivo de meristemos. 


2.3.2.1Genotipo

2.3.2.1Genotipo
El genotipo es la totalidad de la información genética que posee un organismo en particular, en forma de
ADN.[1] Junto con la variación ambiental que influye sobre el individuo, codifica su fenotipo. De otro modo, el genotipo puede definirse como el conjunto de genes de un organismo y el fenotipo como el conjunto de rasgos de un organismo. Por tanto, los científicos y los médicos hablan a veces por ejemplo del genotipo de un cáncer particular, separando así la enfermedad del enfermo. Aunque pueden cambiar los codones para distintos aminoácidos por una mutación aleatoria (cambiando la secuencia que codifica un gen, eso no altera necesariamente el fenotipo). Se le llama genotipo a toda la dotación genética. Hay 23 pares de cromosomas en la especie humana, en total 46. La ordenación recibe el nombre de cariotipo.




2.3.2.- SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES

 2.3.2.- SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES
Para establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.  

2.3.1.4 Adaptación

2.3.1.4 Adaptación
Proceso fisiológico o rasgo morfológico o del comportamiento de características que incrementan la supervivencia y/o el éxito reproductivo.
La adaptación es un proceso normalmente muy lento, que tiene lugar durante cientos de generaciones y que en general no es reversible.Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.
IN VITRO:
No realiza fotosíntesis
Crecimiento en condiciones controladas
Crecimiento en condiciones de asepsia
Alta humedad relativa
Estomas no funcionales
Ausencia de pelos radiculares
Ausencia de cera en la cutícula
EN VIVO:
Realiza fotosíntesis
Crecimiento en condiciones no controladas
Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente
Humedad relativa variable
Estomas funcionales
Presencia de pelos radiculares
Presencia de cera en la cutícula

2.3.1.3 Edad de la planta

2.3.1.3 Edad de la planta
órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. El empleo de explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede resolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro

2.3.1.2 Multiplicación

2.3.1.2 Multiplicación
Multiplicar una planta a partir de ciertos órganos -retoños, tallos, hojas- o por división de matas que ella forma. Para practicar correctamente este tipo de multiplicación, es necesario saber que no son tanto las características de la planta madre, como las del órgano seleccionado, las que son reproducidas. Ello permite aislar ciertos detalles apreciados, tales como el color y el dibujo del follaje.

Se utilizan para ello plantas que han precisado un nivel óptimo de adaptación al medio y se eliminan, mediante las tijeras de podar, todas las partes endebles, pálidas, dotadas de hojas pequeñas o deformes, que llegarían quizás a arraigar, pero que darían origen a ejemplares de pésima calidad. Se escogen, pues,órganos ricos en savia, turgentes y bien formados, que rápidamente emitirán raíces y brotes que darán un ejemplar envidiable.

Se excluirán no sólo las partes que presenten lesiones, aunque sean ligeras, pues las mismas podrían ser de naturaleza parasitaria o infecciosa, sino también los órganos de apariencia sana pertenecientes a plantas afectadas por enfermedades criptográmicas o virosas susceptibles de existir ya en el interior de las células y de manifestarse en un periodo relativamente corto.

En contrapartida, podemos utilizar plantas cuyo marchitamiento no posea un origen patológico, sino debido a una falta de cuidados o a un medio inadaptado, tras haberlas estimulado oportunamente y escogiendo los órganos más vigorosos. Este material de segunda mano debe ser preparado, tratado y cuidado con una atención particular durante todas las fases del proceso de multiplicación.